免疫沉淀是一種能夠純化蛋白質(zhì)的方法。將目標(biāo)蛋白質(zhì)的抗體與細(xì)胞提取物一起孵育，抗體會(huì)與溶液中的蛋白質(zhì)結(jié)合。通過(guò)使用蛋白A/G偶聯(lián)的瓊脂糖珠將抗體/抗原復(fù)合物從樣品中提取出來(lái) 。這可以將目標(biāo)蛋白質(zhì)與樣品的其余部分分離。然后通過(guò)SDS-PAGE分離樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。

裂解緩沖液

理想的裂解緩沖液將最大限度地減少蛋白質(zhì)變性，同時(shí)從樣品中釋放足夠量的蛋白質(zhì)。NP-40和Triton X-100等非離子型去污劑的刺激性低于SDS和脫氧膽酸鈉等離子型去污劑。其他可能影響免疫沉淀成功的變量包括了鹽濃度、二價(jià)陽(yáng)離子濃度和pH值等。為了優(yōu)化變量，應(yīng)在以下范圍內(nèi)測(cè)試它們：

-鹽：0-1 M

-非離子洗滌劑：0.1-2%

-離子洗滌劑：0.01-0.5%

-二價(jià)陽(yáng)離子：0-10 mM

-EDTA：0-5 mM

-酸堿度：6-9

非變性裂解緩沖液

用于可溶于去污劑且可被抗體以天然形式識(shí)別的抗原。Triton X-100可以替代NP-40。

-20 mM Tris HCl pH 8

-137 mM 氯化鈉

-1% Nonidet P-40 (NP-40)

-2 mM EDTA

4°C下最多可保存6個(gè)月，使用前立即添加蛋白酶抑制劑。

為方便起見(jiàn)可配制10%脫氧膽酸鈉儲(chǔ)備液(5g加入50mL)，必須避光。

不含去垢劑的可溶性蛋白裂解緩沖液

一些可溶性蛋白質(zhì)可能不需要使用洗滌劑。此緩沖液用于機(jī)械細(xì)胞裂解，例如使用杜恩斯勻漿器進(jìn)行勻漿。

PBS含有：

-5mM EDTA

4°C下最多可保存6個(gè)月，使用前立即添加蛋白酶抑制劑。

非去污劑可溶性抗原的變性裂解緩沖液

僅識(shí)別變性蛋白質(zhì)的抗體無(wú)法接近天然蛋白質(zhì)的表位。收獲和裂解細(xì)胞時(shí)，在變性裂解緩沖液中加熱細(xì)胞。該方法也可用于無(wú)法用非離子去污劑從細(xì)胞中提取的抗原。使用蛋白酶抑制劑將有助于從染色質(zhì)中提取蛋白質(zhì)。

1% SDS

5mM EDTA

室溫下最多可保存1周。

使用前立即添加

10 mM二硫蘇糖醇或β-巰基乙醇

蛋白酶抑制劑15 U/mL

洗滌緩沖液

-10mM Tris;調(diào)節(jié)pH至7.4

-1mM EDTA

-1mM EGTA；pH8.0

-150mM氯化鈉

-1% Triton X-100

-0.2mM原釩酸鈉

-蛋白酶抑制劑混合物

4°C下最多可保存6個(gè)月。使用前立即添加蛋白酶抑制劑。

其他試劑

蛋白酶抑制劑

細(xì)胞裂解后，蛋白水解、去磷酸化和變性過(guò)程就開(kāi)始了。將樣品放在冰上會(huì)減慢這些過(guò)程，但也可以使用蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物。如果不使用混合物，PMSF(50 μg/mL)和抑肽酶(1 μg/mL)是常用于免疫沉淀的蛋白酶抑制劑。

其他試劑

-無(wú)菌PBS pH 7.4

-無(wú)菌PBS-BSA 1% w/v(過(guò)濾)

-TBST緩沖液

-用于蛋白質(zhì)印跡的上樣/樣品緩沖液

-VeriBlot用于免疫沉淀二抗，在蛋白質(zhì)印跡過(guò)程中優(yōu)先檢測(cè)未還原、未變性 的一抗。

-100mM EDTA庫(kù)存溶液由1.86gEDTA溶解在40mL H2O中制成。添加NaOH 將pH調(diào)節(jié)至7.4。最后將總體積調(diào)整至50 mL。

制備裂解物

細(xì)胞培養(yǎng)物裂解物(非變性)

1，將細(xì)胞培養(yǎng)皿置于冰上，并用冰冷的PBS清洗細(xì)胞。

2，排干PBS，然后添加冰冷的裂解緩沖液(1mL每107個(gè)細(xì)胞/100mm2培養(yǎng)皿 /150cm2燒瓶；0.5 mL每5×106個(gè)細(xì)胞/60mm2培養(yǎng)皿或75cm2燒瓶)。

3，使用冷塑料細(xì)胞刮刀將貼壁細(xì)胞從培養(yǎng)皿上刮下，然后將細(xì)胞懸浮液輕輕轉(zhuǎn) 移至預(yù)冷的微量離心管中。

4，在4°C下保持恒定攪拌30分鐘。

5，在4°C的微量離心機(jī)中離心。

您可能需要根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型改變離心力和時(shí)間。原則是12,000 rpm，20分鐘， 但您應(yīng)該針對(duì)您的特定實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化(例如，白細(xì)胞需要非常輕微的離心)。

6，輕輕地從離心機(jī)中取出管子并置于冰上。吸出上清液并置于冰上的新管中， 并丟棄沉淀。 

細(xì)胞培養(yǎng)物裂解物(變性)

1，將100μL變性裂解緩沖液添加到0.5-2×107個(gè)細(xì)胞中。

2，以最大速度劇烈渦旋2-3秒充分混合。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至微量離心管中。由 于DNA的釋放，溶液在此階段可能會(huì)變得粘稠。

3，將樣品加熱至95°C，5分鐘使其變性。

4，用0.9 mL非變性裂解緩沖液稀釋?xiě)腋∫海p輕混合。

非變性裂解緩沖液中過(guò)量1% Triton X-100會(huì)淬滅原始變性緩沖液中的SDS。

5，將裂解的懸浮液通過(guò)連接到1 mL注射器的針頭5-10次，從而打碎DNA。

通過(guò)重復(fù)機(jī)械破壞，直到粘度降低。如果 DNA存在消化和片段化， 可能會(huì)干擾離心后沉淀與上清液的分離。

6，在冰上孵育5分鐘。

7，繼續(xù)進(jìn)行免疫沉淀。

組織裂解物

1，用干凈的工具盡快解剖組織。如果可能，請(qǐng)?jiān)诒线M(jìn)行以防止蛋白酶降解。

2，將組織放入圓底微量離心管中，浸入液氮中快速冷凍。將樣品儲(chǔ)存在-80°C 下供以后使用或保存在冰上以便立即均質(zhì)化。

3，對(duì)于約5 mg的組織片，將約300 μL裂解緩沖液快速添加到管中，并用電動(dòng) 勻漿器勻漿。

4，每次沖洗時(shí)用另外300 μL裂解緩沖液沖洗刀片兩次，然后在4°C下保持恒 定攪拌2小時(shí)(例如置于冰箱中的定軌搖床上)。

裂解緩沖液的體積必須根據(jù)存在的組織量來(lái)確定。蛋白質(zhì)提取物不應(yīng)太稀，以避免蛋白質(zhì)損失并盡量減少上樣到凝膠上的樣品體積。濃度0.1mg/mL；最佳濃度為1–5mg/mL。

如果需要變性樣品，使用變性裂解緩沖液并執(zhí)行上述變性方案中的步驟2-5。

5，在微量離心機(jī)中于4°C下以12,000 rpm離心20分鐘。輕輕地將管從離心機(jī) 中取出并置于冰上，吸出上清液并置于冰上保存的新管中丟棄沉淀。

預(yù)清除裂解物

預(yù)清除裂解物有助于減少非特異性結(jié)合并降低背景。但如果蛋白質(zhì)的最終檢測(cè)是通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行，則不需要預(yù)清除，除非污染蛋白質(zhì)干擾了目標(biāo)蛋白質(zhì)的可視化。

1，將50 μL與免疫沉淀抗體相同種類(lèi)和同種型的脫靶抗體或正常血清(通常優(yōu)先選擇兔)添加到1 mL裂解液中。在冰上孵育1小時(shí)。

2，將100 μL珠漿添加到裂解液中。

3，在 4°C下孵育10–30分鐘，并輕輕攪拌。

4，在微量離心機(jī)中于4°C以14,000 g旋轉(zhuǎn)10分鐘。

5，丟棄珠粒并保留上清液用于免疫沉淀。

為了提高產(chǎn)量，可以在裂解緩沖液中將珠子洗滌1或2次以上，并將上清液 收集在一起。

重要的是要確保盡可能多地去除正常血清。為了確保這一點(diǎn)，可以使用裂解緩沖液代替樣品進(jìn)行測(cè)試，并執(zhí)行上述所有預(yù)清除步驟。

將所得上清液進(jìn)行凝膠電泳并用考馬斯染色顯示血清Ig是否被有效去除。如果血清未充分去除，重鏈和輕鏈將出現(xiàn)50和25kDa的條帶；它的存在可能會(huì)導(dǎo)致免疫沉淀反應(yīng)較弱。考慮減少血清量或增加預(yù)澄清步驟中與樣品一起孵育的珠子量。